论文：高产早熟香菇新品种选育实验报告

                                                                           高产早熟香菇新品种选育实验报告
                                                         ──原生质体技术在食用菌育种中的应用研究之一
                                                                中国科学院北京农村经济技术开发部      梁枝荣
　　摘要  栽培用香菇菌株原生质体经UV处理后，进行再生培养选育，筛选出了产量高、出菇早的香菇新品种。
　　关键词  香菇  原生质体  UV处理  出菇试验
　　食用蘑菇菌丝多核、担孢子壁厚的特点造成诱变育种的困难。通过菌丝原生质体的分离可以将菌丝中的细胞核分离成单个的体细胞，发育成新的菌株。脱壁后的原生质体对诱变因子的敏感性增强，增加了变异的机会，提高了诱变率。根据这个原理，我们进行了香菇菌丝原生质体的紫外线诱变育种研究，现将初步结果整理总结如下，供同行参考。
　　I. 材料和方法
　　1.1  菌株：Ｌ３８，  Ｌ１３，生产中栽培用菌株
　　1.2. 培养基：见表１
               表１  本实验中使用的培养基和化学试剂
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名称*                         组成成分(克/1000毫升)
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完全培养液(CM)：  硫酸镁0.5，磷酸二氢钾0.46， 磷酸氢二钾1.0，蛋白胨2.0，酵母浸汁2.0， 葡萄糖20.0
完全固体培养基(CMA)：    CM加20.0克琼脂
高渗稳定完全培养液(OCM)：CM加0.6克分子量的硫酸镁
高渗稳定液(OSS)：        0.6克分子量硫酸镁, 0.05克分子量马来酸, 酸碱度5.8
裂解酶液(ES)：           1.5%裂解酶溶于OSS
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　　 1.3. 栽培袋培养料：木屑６５％，夫皮２０％，茶叶渣１５％，料水比1:1.6，拌匀装入直径１５X３０厘米的聚丙烯袋，每袋装湿料６５０克，高压灭菌。        
　　1.4. 原生质体分离
　　完全培养液内２５度摇床培养７天的香菇菌丝体，用高渗稳定液多次冲洗后加入酶液，２５度裂解５小时，玻璃纤维过泸，泸液离心收集原生质体，用高渗稳定液冲洗两次。
　　1.5. 原生质体诱变和双核再生体的检出
　　原生质体稀释液在黑暗中用紫外线灯以７.５尔格的剂量分别处理０秒、１０秒、１５秒、２０秒和３０秒。处理后的原生质体溶液均匀涂抹于完全高渗培养基平板。黑暗中２５度培养再生１０－１５天，将单个再生菌落转接到CMA平板，２５度培养５天后，通过显微镜观察检出双核再生体。
　　1.6. 菌丝生长和出菇试验
　　从再生菌株和亲本菌株菌落上切取直径0.3厘米的小园片分别转接入CMA平板中心，每个菌株做５次重复，24度暗光培养，定期观察，于第21天测量菌落直径。
　　再生菌株和亲本菌株分别接入栽培袋，每个菌株做５次重复，暗光下２４度培养，定期观察，于第５５天测量记载菌丝从袋口接种处到菌丝生长前沿长度。６０天菌丝满袋，脱袋喷水２０度进行转色出菇培养。现蕾后进行出菇管理，子实体成熟后喷水前采菇称重，记载统计三潮菇的产量。
　　II. 结果和讨论
　　2.1  原生质体分离和再生
　　采用本实验所用的原生质体分离再生方法，一般可得到５Ｘ１０6担ml以上的原生质体，再生率在0.3-0.8%之间，原生质体量和再生率可完全满足实验所需。
　　 2.2. 双核菌丝的检出
　　 再生菌落经显微镜观察，约有１０％左右是单核菌丝，从单个再生菌落中挑选双核菌丝体转接入CMA平板，培养成再生菌株，做进一步的研究。       
　　2.3 再生菌株和亲本菌株菌丝的生长   
　　如表２所示，２５度培养２１天CMA平板培养基上菌落直径在2.9-4.6厘米之间， 大部分分布在3.6-4.0厘米之间，其中生长最快的是L38-2， 直径达到4.6厘米， 生长最慢的是L38-34和L38-55，直径分别是3.0和2.9厘米；两株亲本菌株的直径是3.8厘米。 栽培袋内菌丝长度大部分在11.3 和12.2厘米左右， 其中生长最快的是L38-37，菌丝长度达到13厘米， 最慢的是L38-2和L38-6， 菌丝长度分别是10.5和10.3厘米；两株亲本菌株菌丝长度分别是11.5和12.2厘米(表3)。两种培养基上亲本菌株的生长速率均处于中间范围，结果表明通过原生质体分离诱变得到的再生菌株之间菌丝生长特性有了明显的分化变异。
 表2  CMA平板培养基上再生菌株和亲本菌株菌丝的生长速率
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                              　　 再生菌株           亲本菌株
菌落直径(CM)  直径平均值(CM)     ───────────   ──────
                                   数量(株)    比率(%)     数量(株)
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2.9-3.0            3.0                 6             5.7                
3.1-3.5            3.3                 3             2.9      
3.6-4.0            3.8                 30            28.6       2
4.1-4.5            4.3                 63            60      
4.6                    4.6               3                2.9      
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     表3 栽培袋内再生菌株和亲本菌株菌丝的生长速率
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　　　　　　　　          再生菌株                亲本菌株
菌丝长度(CM)   平均值(CM) ──────────────     ─────
                             数量(株)       比率(%)        数量(株)
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9.9 -10.5        10.2           6              5.7
10.6-11.2      10.9           15             14.3
11.3-11.9      11.6           48             45.7           1(L13)
12.0-12.6      12.5           30             28.6           1(L38)
12.7-13.3      13.0           6                 5.7
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　　2.4. 再生菌株和亲本菌株的出菇期与出菇产量
　　亲本菌株的出菇期为44-50天，出菇期最短的６株再生菌株在30-36天之间，而有３株再生菌株出菇期最长为57-63天，两株亲本出菇期在44-50天之间，结果表明通过原生质体分离诱变得到的再生菌株出菇期也出现了较大的分化变异（表4）。
　　如表5所示，亲本菌株的产量在56-127克的范围内，再生菌株的产量变异幅度较大，其中有６株没有出菇，而有６株的产量超过亲本菌株１倍以上，两株亲本菌株的产量处于平均值略微偏低一点的水平，结果表明，通过原生质体分离诱变可筛选得到产量大幅度提高的变异菌株。 
                    表4 再生菌株和亲本菌株的出菇期
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　　　　　　　　　　　　　　　　再生菌株                       亲本菌株
出菇期(天)*   平均值(天) ─────────────────     ──────
                             数量(株)       比率(%)               数量(株)
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30-36          33             6              5.7
37-43          40             33             33.3
44-50          47             42             40.0                     2
51-56          54             15             16.1
57-63          60             3              2.9
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   * 出菇期表示从菌丝满袋到80%以上的菌袋现蕾
 
                 表5  再生菌株和亲本菌株出菇产量比较
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　　　　　　　　　　　　　　  再生菌株                      亲本菌株
产量(克)       平均值(克) ─────────────    ────────
                              数量(株)  比率(%)               数量(株)
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0                    0                 6           5.7
10-55            32.5             21       20.0
56-101          78.5           18        17.1                   1(L38)
102-147        124.5         21        20.0                  1(L13)
146-193        168.5         21        20.0
194-239        214.5         12        11.4
240-285        262.5         6         5.7
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　　2.5. 再生菌株产量的稳定性
     选出两株产量较高的再生菌株通过组织分离得到下一代，连续两代经重复栽培实验，其高产早熟的特性稳定（表6）
               表6  再生菌株后代与亲本菌株产量出菇期比较
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                             产量(克)                     出菇期(天)
实验菌株            ──────────────    ─────────────
                    第一     第二代    第三代     第一代  第二代    第三代
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亲本菌株 L13        110       128       124       46        44        48
再生菌株 L13-4      222       267       249       31        35        32
再生菌株 L13-8      185       241       237       33        30        31
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　　III. 小结
　　 本实验的目的就是以香菇为材料，探讨通过原生质体的分离诱变进行食用菌菌种选育的可能性。香菇菌丝原生质体通过不同剂量紫外线的处理，选出了１０５株再生菌株，这些菌株的菌丝生长特性、出菇量、出菇期与它们的原始菌株进行了比较，一些再生菌株获得了高产早熟的优良特性。选出的几株优良菌株经过多次继代栽培，所获得的优良特性表现稳定。结果表明，原生质体分离诱变是一种很有应用价值的食用菌菌种选育方法。（原文地址：http://mycologist.blog.163.com/blog/static/103586098201031201825229/）