蛹虫草菌种复壮技术的研究

       我所经过多年研究，人工驯化栽培蛹虫草获得成功，并实现了规模化生产。但在生产实践中，我们遇到了一个普遍性的难题，就是蛹虫草菌种的遗传变异显著，优良性状不能完全稳定遗传，且极易老化或退化。一般来说，从野生蛹虫草菌株中分离的一个较好菌株，幸运的话可能会使用1～2年，保持优质高产。但通常是使用半年左右，甚至是传种几代后菌种就严重退化，表现特征是不长或只长出极少量子实体，而且质量极差，给批量栽培带来极大的风险。为了降低这种因菌种退化而带来的风险，我们在菌种复壮方面做了大量工作，获得了适合于蛹虫草菌种复壮的较好方法。现介绍如下，供广大同行参考。
    1 材料与方法
    1.1 试验材料
　　① 菌株cm-A，由本实验室提供。
　　② 培养基及培养条件：
　　培养基配方：1000mL培养基中土豆200g，蔗糖30g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3g，VB1，1mg。最后调pH为6～6.5（固体培养基加2%的琼脂粉即可）。土豆去皮后称200g，切小块，煮开后继续煮0.5h，4～5层纱布过滤，高压灭菌30min。
　　培养条件：24～25℃静止培养2d后，120r/min，培养5d。
    1.2 试验方法
    1.2.1 组织分离法 选无杂菌的罐头瓶中长度2～3cm状态好的子实体，用无菌水冲洗，刮掉表层，取肉质1mm大小于斜面培养基上，24～25℃培养15d，菌丝布满斜面，再经子实体栽培，反复筛选，得到菌株cm～B。
    1.2.2 孢子分离法 选择形态好、生长势健壮并能代表该品种性状的接近成熟子实体，悬挂式采孢子于PDA固体培养基上，24～25℃培养成单个菌落，再将单个菌落移到斜面培养基上，继续培养到菌丝布满斜面。然后经子实体栽培，反复筛选，得到菌株cm-C。
    1.2.3 虫体回接法 将试验室保存的母种cm-A接种到液体培养基中培养成菌悬液5层纱布过滤，滤液待用。取刚化蛹的柞蚕蛹，用75%乙醇消毒。用医用注射器将上述菌液注射到蛹体内，24～25℃培养变成僵蛹。取长满菌丝的体内组织粒到PDA斜面，24～25℃条件下继续培养到菌丝布满斜面，再分离纯化得到菌株cm-D。
    1.2.4 耐高温试验 将复壮后的新菌株各取1支试管种置34℃恒温箱24h。
    1.2.5 菌丝生长试验 将复壮后的新菌株及亲本菌株各取一小块接种到盛有PDA固体培养基的培养皿中央，24～25℃下培养3d开始观察，观察10d后结束试验。
    1.2.6 子实体栽培 取cm-A、cm-B、cm-C、cm-D相同大小、数量的菌块接种到PDA液体培养基中，24～25℃静止培养2d后，120r/min摇床振荡培养5d，接种米饭罐头瓶中，每个测试样30瓶，相同管理条件下培养、观察，计算平均单瓶产量（鲜重）。
    2 结果与分析
    2.1 耐高温试验 将复壮菌株cm-B、cm-C、cm-D试管菌丝置34℃恒温箱24h，未发现吐黄水，但生长速度变得缓慢，重新置24℃环境中，恢复了原有的生长速度，说明复壮菌株能耐一定高温。
    2.2 菌丝生长情况 cm-B、cm-C、cm-D与亲本cm-A相比，菌丝日平均生长量都有提高，具体见表1。
    表1 菌种复壮前后菌丝生长情况（mm）
    菌 株    cm-A  cm-B  cm-C  cm-D
    日均生长 4.12  5.21  5.51  5.84
    2.3 子实体栽培试验 三种方法复壮的菌种经子实体栽培试验，通过观察比较，发现cm-D转色最快，cm-B及cm-C次之。出草天数均提前4～5d，而且子实体比较均匀，且个数多，从而产量也有明显的提高。具体见表2。
    3 讨论
    通过上述试验，可以看出，蛹虫草的菌种复壮采用这三种方法均是可行的。但因蛹虫草菌种要求外界条件严格，受外界因素影响明显，仅以常规方法进行复壮，还不能真正解决菌种退化问题。目前，研究发现组织细胞产生的脱氢酶与细胞活力成正比，通过对脱氢酶的测定来提早淘汰退化菌株，减少损失。下一步我们主要从遗传物质DNA入手，通过分子标记技术RFLP和RAPA。比较正常菌株和退化菌株在基因水平的变异情况，利用电泳图谱观察与退化特征相联系的特异条带，确定突变基因，想办法“治疗”发生变异的基因，最终找到一种很好的解决菌种退化问题的办法。
    表2 菌种复壮前后子实体栽培情况
    菌 株        cm-A  cm-B  cm-C  cm-D
    转色         一般  快    快    快
    出草天数（d） 16   10    12    10
    产量（s/瓶） 15.5  20.1  22.3  19.8
    辽宁省农科院大连生物技术研究所,李亚洁 王鹤 孟楠 石理鑫 王林华