灵芝与糙皮侧耳原生质体融合子 生物学特性的初步研究（ 2004.02.14)
王淑珍1，范俊1，扬家峰1，扬英杰1，白晨2(1上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234；
2复旦大学生命科学学院，上海200433)
灵芝(Ganoderma lucidum)是滋补强壮、扶正固本的珍贵药用真菌，随着科学技术的发展，对其研究更加深入，但未见过有关通过遗传育种改变灵芝担子果木栓质化生物学特性的研究报道。若将外源DNA导入灵芝细胞，嵌入细胞的遗传物质结构中，就有可能改变其木栓质化遗传特性。本研究是在对灵芝、糙皮侧耳及其融合子基因组RAPD分析…的基础上，分析检测其部分生物学特性，以期了解融合子木栓质化改变程度及木栓质化与其他生物学特性的相关性。
1材料与方法
1．1材料
1．1．1菌株长白山野生紫芝诱变高产菌株CJL990[2]，由上海师范大学王淑珍研究组提供；糙皮侧耳(Peurotus ostreatus)菌株农科2号，引自上海市农业科学院食用菌研究所。
1．1．2 PDA培养基供测定菌丝生长速度用。
1．2方法
1．2．1菌丝生长速度的测定将灵芝、糙皮侧耳及其融合子(F1～F19)菌株分别接种于PDA培养基上，28℃培养7d，每天测量菌落生长直径。两亲本与每株融合子均重复三次，计算平均值。
1．2．2液态培养生物量的比较分别取10小块直径O．15～0．25cm、于斜面上生长良好的灵芝、糙皮侧耳及其融合子菌丝体，将其接入PDA液体培养基，于28℃、130r／min摇床培养。7d后，过滤收集菌丝体。用无菌水冲洗3遍，吸干水分置于培养皿中，于105℃烘干至恒重，记录干重。融合子及亲本菌丝均重复三次，求平均值。
1．2．3融合子菌丝形态的观察分别在PDA培养基上插片培养亲本菌丝和融合子菌丝，待菌丝生长到插片上0．5～0．7cm后，于200倍显微镜下观察菌丝形态特征并拍照。
1．2．4菌丝木栓质化程度的测试将灵芝、糙皮侧耳及其融合子(F1～F19)分别接种于装200mL PDA液体培养基的500mL三角瓶中，于28℃浅层培养15d，长成直径8cm、厚0．3cm的湿菌丝膜，再通过GB453-89恒速加荷法测定菌丝膜的抗拉强度，间接反映菌丝木栓质化程度。
2结果
2．1菌丝生长速度
灵芝、糙皮侧耳及其融合子(F1～F19)菌丝在PDA固体培养基中的生长速度见表1。
从表1可见，所有融合子7d的平均菌丝生长速度为5．08cm，介于两亲本之间。相对于灵芝，F1、F9的菌丝生长速度明显减慢，而F3、F6、F7、F12、F13、F14、F15、F16、F17、F18和F19的菌丝生长速度则明显提高。菌丝生长速度最快的F8，已与糙皮侧耳的菌丝生长速度相同。
根据亲本和所有融合子菌落直径每天的平均生长值绘图。从图1可见，融合子菌丝的平均生长速度介于两亲本之间。
图1 亲本及其融合子在PDA培养基上的菌丝生长速度
Fig．1 Comparison Of mycelial growth rate 0f parent strains and the fusants On PDA medium
2．2液体培养灵芝、糙皮侧耳及其融合子的生物量
从表2可见，融合子与亲本在液体培养时生物量差异不大，其中菌丝生长速度较快的F8，生物量较高，所有融合子的平均生物量为7．99g/7d，介于两亲本之间，液体培养和固体培养的亲本及其融合子的生物学特性具有一定的相关性。
2．3灵芝、糙皮侧耳及其融合子(F8)的菌丝形态
在200倍显微镜下观察菌丝体，比较菌丝形态特征，箭头所指为锁状联合(图2～4)。从图2可见，灵芝及其融合子的菌丝长得较紧密，糙皮侧耳菌丝较疏松。融合子菌丝感官观察较透明，经测微尺测定，其直径为6．5～8μm，大于两亲本菌丝(灵芝菌丝3～5μm，糙皮侧耳菌丝4．5～6μm)。
2．4灵芝、糙皮侧耳及其融合子菌丝木栓质化程度的比较
由表3可见，以抗拉强度表示的融合子菌丝的木栓质化程度与灵芝菌丝相比均有不同程度下降。F12菌丝的抗拉强度为23．6N，其木栓质化程度几乎与灵芝相同；F8菌丝的抗拉强度最小，为16．9N，但也远远大于糙皮侧耳的3．8N。菌丝抗拉强度的大小反映其韧性的强弱，抗拉强度大，其韧性也大，说明其木栓质化程度高。
3讨论
3．1灵芝和糙皮侧耳原生质体融合子与双亲的生物学特性具有不同程度的差别。灵芝、糙皮侧耳及其融合子的基因组RAPD…和同工酶的分析[3]结果表明，融合子的谱带有的与灵芝的相同，有的与糙皮侧耳的相同。虽然本研究未进一步进行分子杂交法验证[4]，但由RAPD的原理也足以说明，融合子的谱带不是双亲谱带的简单叠加，融合子中还出现了新的谱带，是原生质体融合引起细胞核或细胞质基因高频重组的结果。初步证明，融合子生物学特性的改变与基因相关，从融合子与两亲本的相似系数来看，两株融合子的平均Spf为60．65％，而Spf为32．35％。可以看出融合子与灵芝更接近。
3．2融合子菌丝的木栓质化程度与灵芝相比均有不同程度的下降，其中，F8的降幅最大。菌丝形态变化也大，表明融合子菌丝的木栓质化程度与其它生物学特性(如菌丝的透明度和直经大小)具有一定的相关性，即菌丝生物学特性变化大，其木栓质化程度就低。
3．3 19株融合子菌丝木栓质化程度不同，是否决定菌丝或子实体木栓质化生物学特性的基因较复杂，不是单一基因，尚有待进一步研究。
参考文献[1]王淑珍，白晨，范俊，等．灵芝与糙皮侧耳原生质体融合子基因组RAPD分析[J]．食用菌学报，2003，10(1)：1--4．
[2]王淑珍，白晨．灵芝孢子诱变与菌丝高长速菌株选育[J]．中国食用菌，2000，106(6)：6--9．
[3]王淑珍，范俊，高雁，等．孢子诱变菌株CJL990灵芝过氧化物酶和酯酶同工酶的研究[J]．上海师范大学学报(自然科学版)，2000，29(4)：69--73．
[4]潘迎捷，陈明杰，汪昭月．原生质体的融合子的遗传验证[J]．食用菌，1991，13(6)：14～15．
