草菇DNA提取方法初探
江玉姬， 谢宝贵， 陈文校
(福建农业大学土地与环境学系微生物教研室，福建 福州 350002)
摘 要：研究了3种DNA提取方法对草菇DNA提取的影响。结果表明，CTAB提取法DNA产量高，多糖和蛋白质含量低，符合分子生物学研究要求；氯化苄提取法DNA产量最高，蛋白质含量较低， 但多糖含量高，需要进一步去除；原生质体提取法DNA产量极低，而且蛋白质含量也较高，不适合于草菇DNA提取。
关键词：草菇；DNA提取方法
中图分类号：Q 89；S 646.13 文献标识码：A
Ways of extracting DNA from Volvariella volvacea
JIANG Yu-ji,XIE Bao-gui,CHEN Wen-xiao
(Department of Land and Environmental Science,Fujian Agricultural University,
Fuzhou 350002,China)
Abstract：Three different ways of extracting Volvariella volvacea DNA was studied.The result showed that the way of using Benzyl chloride got high yield of DNA and low concentration of protein but polysaccharide was higher; The way of using CTAB got a good yield of DNA and low concentration of polysaccharide and protein.It was a good way for extracting Volvariella volvacea DNA.The way of using protoplast got very poor yield of DNA.
Key words：Volvariella volvacea;DNA extraction
草菇为初级同宗结合的食用菌，具有复杂的生活史，这给草菇的遗传学研究和杂交育种等带来了极大的困难,约束了草菇新优高产品种的筛选。本文试用了几种不同的DNA提取法，对草菇DNA的提取方法进行了初步研究，寻找一种快速、简便的DNA提取法，以便于进一步研究草菇的分子生物学特性。
1 材料与方法
1.1 菌株 草菇NO.1菌株由福建农业大学地环系微生物教研室提供。
1.2 供试培养基 PDA培养基： 马铃薯200 g、 葡萄糖20 g、KH2PO4 1.0 g、MgSO4 0.5 g、琼脂20 g、水1 000 ml；去琼脂为液体培养基。
1.3 菌丝体获得 菌丝体培养：将适龄的斜面菌种耙弃气生菌丝并用接种耙切碎培养基，耙入装有适量玻璃珠及50 ml无菌水的三角瓶中，振荡打碎培养基制成菌悬液，然后接入装有100 ml液体培养基的250 ml三角瓶中，每瓶接种10 ml。35℃静置培养48 h。
菌丝体过滤：将液体培养物用65目铜网过滤， 无菌水洗涤过滤2次，0.4 mol.L-1 KCl洗涤过滤，滤纸吸干水分，收集菌丝体。
1.4 主要化学试剂 氯化苄（分析纯），上海化学试剂总厂所属上海试剂二厂生产；CTAB (十六烷基三甲基溴化铵，分析纯），上海化学试剂站中心化工厂生产；EDTA（乙二胺四乙酸二钠， 分析纯），广东汕头金砂化工厂生产；SDS（十二烷基磺酸钠)，上海化学试剂采购供应站分装厂；Tris (三羟甲基氨基甲烷，生化试剂），上海化学试剂采购供应站分装厂；氯仿（分析纯），上海试剂一厂生产；异戊醇（分析纯），上海试剂一厂生产。
1.5 DNA提取方法
1.5.1 氯化苄法 参照朱衡等［1］描述的方法，称取4 g菌丝体，加20 ml提取液(0.1 mol.L-1 Tris.HCl,pH 9.0;0.04 mol.L-1 EDTA,pH 8.0)，振荡使之与菌体充分混均，再加入4 ml 10% SDS、12 ml氯化苄， 剧烈振荡，使管内混合物呈乳状。50℃水浴1 h，每隔10 min振荡1次，然后加入12 ml的3 mol.L-1 NaOAc混匀，冰浴15 min，4 000 r.min-1离心15 min，取上清液，加入等体积异丙醇，振荡混合均匀后分装于10 ml离心管中，室温沉淀20 min，这时可见絮状沉淀出现。4 000 r.min-1离心15 min，收集沉淀，用适量70%酒精洗1次，4 000 r.min-1离心15 min，弃上清液，收集沉淀。
1.5.2 CTAB法 参照Borroso［2］描述的方法，取4 g 菌丝体放入冰箱中冻结，然后置于研磨钵中研磨成浆，转入10 ml的离心管中，加入2.8 ml提取缓液(0.01 mol.L-1 Tris.HCl,pH 8.0;2% CTAB，w/v; 0.02 mol.L-1 EDTA；1.4 mol.L-1 NaCl；2%巯基乙醇，v/v），50℃水浴20 min，加入2.8 ml氯仿－异戊醇混合液(24/1, v/v)，振荡均匀形成乳浊液，分装于2支10 ml离心管中，4 000 r.min-1离心30 min，收集上清液，加入4 ml沉淀缓冲液(0.05 mol.L-1 Tris.HCl, pH 8.0;1% CTAB，w/v；0.01 mol.L-1 EDTA)混合均匀，置室温沉淀30 min。然后在4 000 r.min-1离心15 min，收集沉淀，倒置离心管沥干。将沉淀物悬浮于2 ml 1 mol.L-1 NaCl中，并加2倍体积冷冻无水乙醇，置冰箱中沉淀30 min。4 000 r.min-1离心15 min，收集沉淀，用10 ml 70%酒精洗涤并于4 000 r.min-1离心15 min，重复3次，制得DNA沉淀。
1.5.3 原生质体法 按照吕作舟等［3］描述的方法制备原生质体，然后加入1 ml TE(0.01 mol.L-1 Tris.HCL,pH 8.0;0.01 mol.L-1 EDTA)(4℃)，混合均匀后再加4～8 ml裂解缓冲液(0.01 mol.L-1 Tris.HCl,pH 8.0;0.01 mol.L-1 EDTA;0.15 mol.L-1 NaCl;0.4% SDS，w/v)，55℃恒温水浴裂解3～4 h(间隔摇动3～4次)；加等体积SS－酚抽提1次，4 000 r.min-1离心10 min，取上清液；加等体积SS-酚/氯仿/异戊醇(25/24/1，v/v/v)抽提1次，4 000 r.min-1离心10 min得上清液；再用等体积氯仿/异戊醇抽提1次，同上述条件离心得上清液；加5 mol.L-1 NaCl至终浓度为0.1 mol.L-1，混合均匀后加2倍体积无水乙醇(4℃预冷) ，置－20℃冰箱中过夜沉淀DNA；然后在4 000 r.min-1离心10 min，用70%酒精洗涤沉淀(莫搅动)，抽干酒精。
1.6 DNA测定 将3种方法收集的DNA沉淀分别溶于5 ml TE (0.01 mol.L-1 Tris.HCl,pH 8.0; 0.01 mol.L-1 EDTA)，取1 ml加4 ml TE(同上)在紫外分光光度计下扫描(200～400 nm)，得吸收曲线，读OD230、OD260、OD280的值 ，计算DNA总量、OD260∶230、OD260∶280。
2 结果与分析
紫外分光光度计扫描结果见表1,图1～3。
图1 氯化苄法提取DNA
Fig.1 The DNA extraction by using Benzyl chloride
图2 CTAB法提取DNA
Fig.2 The DNA extraction by using CTAB
图3 原生质体法提取DNA
Fig.3 The DNA extraction through protoplast way
表1 3种提取方法的DNA测定结果
Table 1 Analysis results of DNAs extracted by different ways
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提取方法 OD230 OD260 OD280 OD260∶230 OD260∶280 DNA总量
(μg)
氯化苄法 0.3680 0.3343 0.1891 0.91 1.77 417.88
CTAB法 0.1461 0.2517 0.1190 1.72 2.12 314.63
原生质体法 -0.000 0.0270 0.0180 1.50 33.75
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试验结果表明，CTAB提取法产量高，多糖和蛋白质含量低，符合分子生物学研究要求；氯化苄提取法产量最高，蛋白质含量较低，但多糖含量高，需要进一步去除；原生质体提取法DNA产量极低，而且蛋白质含量也较高，不适合于草菇DNA提取。
［参考文献］
［1］朱衡,瞿峰,朱立煌.利用氯化苄提取适合分子生物学分析的真菌DNA［J］.真菌学报，1994，13(1):34-40.
［2］ Borroso G,Perennes D，Labarere J.A miniprep method for RFLP analysis and dsRNAS detectiond perfected in the cutivated fungus Agrocybe aegerita［C］.Science and Cultivation of Edible Fungi,1995，87-94.
［3］ 吕作舟.食用真菌基因工程实验技术［J］.中国食用菌，1992,11(1):13.
