毛木耳多糖对小鼠腹腔巨噬细胞蛋白激酶A活性的影响
王道福 邵林萍 鞠保文 丁望
(89医院 潍坊261000)
毛木耳多糖(Auricularia polytrica Sacc polysac caride，APSP)系从担子菌纲银耳科毛木耳(Auricularia polytrica Sacc)子实体中提取，具药食两用价值，有滋补强壮、扶正固本之功效。现代药理学研究证明，毛木耳多糖具有免疫增强和抗肿瘤作用，但其作用机制尚未明确。为进一步探讨毛木耳多糖的作用机理，本文采用PLC法，测定毛木耳多糖均一体组分APSP－A对小鼠腹腔巨噬细胞(MΦ)PKA活性的影响。
1 材料和方法
1.1 药品和试剂毛木耳多糖(APSP－A)：按文献方法提取〔1〕，化学性质属酸性杂多糖，由甘露糖、葡萄糖、木糖、岩藻糖及少量糠醛酸组成，4种单糖的分子比为320∶10∶018∶005，分子量12万，实验时以EPES缓冲液配成所需浓度，滤膜过滤，消毒，4℃保存。RPMI－1640培养基：Gibco生命技术公司产品。胎牛血清(FCS)：杭州四季青生物工程公司。EPES缓冲液(p 72～74)、Sucrose、DTT、Leupetin、histone(Ⅲ－s)、PMSF、ATP、ADP、AMP、cAMP均为Sigma产品。甲醇、PiCA，皆为国产色谱纯。
1.2 动物：昆明种纯系小鼠，♀♂不限，7～8周龄，体重232～255g，由昌潍医学院实验动物中心提供。
1.3 巨噬细胞的培养：按文献方法〔2〕无菌取小鼠腹腔MΦ，经苔盼蓝染色细胞活率90%以上，调整细胞浓度为108～109/L，接种于多孔培养板中，置含5%CO2，95%空气孵箱中，37℃孵育24。对照组皆以RPMI－1640完全培养基替代，实验组中加测试药物等处理因素皆以RPMI－1640完全培养基溶解和稀释。
1.4 PKA活性测定
1.4.1 PKA的制备：按文献方法[3]操作。
1.4.2 PKA活性测定：参考文献[4]以反相离子对高效液相色谱法测定〔4〕。色谱条件：C18柱、流动相：甲醇：磷酸盐缓冲液(21∶79V／V，p69，内含6mmol/L PiCA)、流速1ml/min、检测波长259nm、柱温为室温、0.01AUFS、进样量10～20μl。
1.4.3 蛋白含量测定：按Lowry法测定。
1.4.4 PKA活力定义：一个酶活力单位相当于每分钟使组蛋白istone(Ⅲ－s)磷酸化而消耗1nmol ATP所需的酶量。
1.5 统计学处理结果以?x±s表示，所有结果显著性差异皆以配对资料t检验处理。
2结果
毛木耳多糖对小鼠MΦ中PKA活性的影响：以80mg/L APSP－A与MΦ一起孵育不同时间后，测定PKA总活力。结果显示：APSP－A可明显增强小鼠腹腔MΦ中PKA总活力，8min时达到峰值，至20min恢复到基础水平(图1)。在8min时APSP－A与PKA的量效关系具有一定浓度依赖性(r=08958，表1)，实验测得PKA的基础总活力为(9686±688)nmol?min－1?mg－1(n=3，x±s)。
3讨论
蛋白激酶是催化体内蛋白磷酸化的酶类，而蛋白磷酸化则是体内各种生物反应最终起作用的通路。PKA是一类cAMP依赖性蛋白激酶，是整个cAMP作用的分子基础，在真核细胞内几乎所有cAMP的作用都是通过活化PKA，从而使底物蛋白发生磷酸化而实现。本实验证明毛木耳多糖可引起小鼠腹腔巨噬细胞PKA活性明显升高并具有一定浓度剂量依赖性，提示其免疫增强作用可能与活化PKA有关。
参 考 文 献
1 吴春敏，等毛木耳多糖的分离、分析及免疫药理活性的研究中国药科大学学报1991；22(2)：97
2 鄂征主编组织培养技术北京：人民卫生出版社，1993：185
3 李明春，等灵芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞蛋白激酶A活性的影响中草药2000；31(5)：353
4 李明春，等反相离子对PLC法测定细胞中蛋白激酶活性中国生化药物杂志1999；20(5)：233
