优质的香菇菌种是获得高产、高经济效益的有力保证。菌种制备可经过纯种分离、试验→母种制备→原种制备→栽培种制备→菌种保存等流程。
一、纯种分离及出菇试验：选择出菇早、出菇均匀、成丛的、朵形好、粗壮肥大、柄短、色泽好、八成成熟的菇体为种菇。用孢子分离法或组织分离法或菇木分离法，用马铃薯葡萄糖琼脂或玉米粉琼脂培养基进行纯种分离，在摄氏22—26度环境中培养，经10—20天长成菌落，挑取色白、健壮、无病虫害菌丝转入斜面培养。经2—3次纯培养后，并经出菇试验，选取优良菌株用作制母种。
二、母种制备：取经出菇试验的纯种，用马铃薯葡萄糖琼脂在摄氏24—26度培养。母种可转3—4代扩大培养。
三、原种制备：把母种用与栽培料接近的培养基进行扩大培养，得原种。原种也可直接用于栽培接种。原种培养基：锯木屑78%、米糠或麸皮20%、蔗糖1%、硫酸钙1%、水适量。装入750毫升菌种瓶，包扎好在1.5公斤压力下1小时灭菌。接入母种后在摄氏24—26度培养30—40天至菌丝长满瓶。
四、栽培种制备：栽培种是原种的进一步扩大生产，直接用于栽培接种的，培养基配方及培养条件与原种的相同。也可用木块作菌种培养基。用1.5—1.8厘米厚、直径1厘米的圆木粒或楔形木块1000个，木屑100克，米糠50克，水150—200毫升。先把木粒在水中浸透，再用浸过木粒的水拌料，然后装入菌种瓶在1.5公斤压力1小时灭菌后接种培养。
五、菌种要求：香菇菌丝体白色，一部分长入料内，一部分气生，外观有弹性。菌丝结块好，成熟的 菌丝体表面菌丝块变成茶褐色，有香菇的特殊气味，无病虫害，健壮。菌种长至1/3瓶时，可把培养室温度降低摄氏2—3度，有利菌种的生长。成熟菌种应存放在阴凉、干爽、洁净的环境中，防止污染和放缓生长，免加速老化。
